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简答题制造突变的主要分子生物学方法、原理是什么？
  • （1）定点突变：定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。
    几种寡核苷酸介导的基因突变方法：
    ①Kunkel 突变法 利用Kunkel 法以M13噬菌体DNA为载体进行寡核苷酸介导的位点特异性突变
    ②基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③基于去除特定限制酶切位点的突变
    （2）蛋白质的体外分子定向进化
    ①易错PCR（Error prone PCR）：通过改变PCR反应条件，如降低一种dNTP的量（降至5%-10%）、以dITP来代替被减少的dNTP、增加Mn2+和Mg2+的浓度或使用低保真度的DNA聚合酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。
    ②DNA 搅乱重组（DNA shuffling）：将来源不同但功能相同的一组同源基因，用核酸酶Ⅰ消化成随机片段，由这些随机片段组成一个文库，使之互为引物和模板进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板互换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮的体外重组。

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