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简答题何谓反义技术？试述其主要分类及其原理。
  • 反义技术（antisense technique）是根据碱基互补原理，用人工或生物合成特异性互补DNA或RNA片段（即反义核酸），使之能特异地与目的核酸片段互补结合，从而抑制甚至阻断目的基因表达的一种技术。根据所用反义核酸的不同，反义技术可分为反义寡核苷酸技术、反义RNA技术和核酶技术等。
    反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASON）技术根据碱基互补结合原理，人工或生物合成与目的DNA或RNA互补的寡核苷酸，将其导入细胞，通过其与胞内目的DAN或RNA特异结合，抑制甚至阻断目的基因转录和/或翻译，达到人工调控基因表达的目的。
    ASON主要通过一下几种机理调节基因表达：
    （1）形成三螺旋DNA（triplex DNA）或D环（D-loop）结构；
    （2）与细胞内目的mRNA互补结合，形成DNA-RNA异源杂交体，激活核糖核酸酶H（RNase H）特异性降解mRNA；
    （3）与核内不均一RNA（hnRNA）互补结合，破坏正常剪接形成mRNA的过程；
    （4）与核糖体rRNA的mRNA结合位点互补结合，阻止mRNA的结合和翻译启动；
    （5）ASON与mRNA互补结合，破坏其进入正确翻译部位的途径。
    反义RNA（antisense RNA）是一类自身没有编码功能，但能通过配对碱基间氢键与目的RNA特别是mRNA的特定区域补结合，从而抑制基因表达的小分子RNA。在实际操作中，可采用自然存在或人工合成的反义RNA，通过基因重组将其反向插入到表达载体，然后以此重组表达载体转染细胞，在细胞内产生大量翻译RNA。
    其作用机理包括：
    （1）与引物RNA结合或作用于引物前体，阻止引物与DNA结合，抑制DNA复制；
    （2）在转录水平或转录后加工过程中，阻止特定基因转录，或与mRNA5’端结合，阻止加帽过程；或与剪接位点结合，阻止mRNA的剪接形成等；
    （3）与SD序列或编码区关键点如AUG结合，阻止mRNA与核糖体结合，阻断翻译等。
    核酶是具有生物催化活性的RNA，能按碱基互补原理识别特定核苷酸序列并特异地剪切底物RNA分子。根据其分子大小可分为大分子核酶和小分子核酶两种，前者包括I型内含子（group I intron）、II型内含子（group II intron）和核糖核酸酶P的RNA亚基，均由数百到数千核苷酸组成；小分子核酶按结构分为锤头（hammerhead）型、发夹（hairpin）型等，大小多在35-155个核苷酸之间，应用广泛。根据核酶的结构特点和目的RNA的特异性序列特征，设计并合成针对目的RNA的核酶基因，构建表达载体，导入细胞内，核酶基因表达后通过特异序列识别并降解目的RNA。

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