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简答题PCR引物设计的基本要求是什么？
  • 1、引物长度一般为15～30个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74℃，影响产物的生成。
    2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3’端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45％-55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值，Tm值计算公式：Tm＝4（G+C.+2（A+T）
    3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。
    4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。
    5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
    6、引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。
    7、引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。
    8、引物的5’端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。

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