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简答题试述细菌种属鉴定的常用分子生物学方法。
  • (1)DNA碱基组成的测定：细菌间DNA分子同源程度可以用细菌DNA分子的G+C或A+T摩尔百分比来反映。亲源关系越近的细菌，G+Cmol%越相近。G+Cmol%含量不同的细菌，为不同种细菌；含量相同的可能为不同种的细菌。不同菌属问G+Cmol%范围在25%～75%之间。细菌的G+Cmol%相当稳定，不受培养条件、菌龄和其他外界因素影响。最常用的方法是热变性法，其次是高效液相色谱法和浮力密度法。
    (2)DNA-DNA杂交：DNA杂交可得出DNA之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。目前最常用的是复性速率法，同一菌的复性率为100%；80%～90%的同源为同一种内同一亚种的细菌；60%～70%同源性为同一种内不同亚种的细菌；20%～60%同源则是同一属中的不同菌种。这种方法还可对新菌种或表型性状差别很小而难以肯定的菌株做出较可靠的判定，并可修正其他方法的分类和鉴定错误。
    (3)165rRNA同源性分析：①rRNA-DNA杂交。变性rRNA与变性DNA混合时，rRNA与其互补的DNA链形成杂交双链，rRNA分子与异源DNA杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交双链的稳定性与其同源性成正相关，适于细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是硝酸纤维膜结合法。②165rRNA序列测定。rRNA分子具有高度保守性，在所有的细胞生物中都存在，在长期的进化中，16SrRNA的总碱基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互对齐进行比较。
    (4)165-235rRNA序列测定：在165和235rRNA的间隔区，各菌种的长度是不一样的，利用包含165和235rRNA部分序列的引物对间隔区进行扩增，分析其长度多态，或结合RFLP技术进行分析来鉴定菌种。
    此外限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、随机引物扩增法(RAPD)等技术常用于菌株间的差异比较。

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