试题详情
简答题请说明基因测序的原理。
  • 人类基因组计划的基因测序主要用了以下四方面相互配合与补充的研究方法和技术：
    ①基因连锁图分析
    基因连锁图又称遗传图，遗传分析以具有遗传多态性的遗传标记为路标，利用人类家族遗传史和染色体上基因交换频率的实验数据，推断任何两个已知性状的基因之间的距离，根据点测交试验确定各基因的相对位置和排列顺序，作出包含人类染色体上多个基因、包括酶切位点和其他标记的连锁图。连锁图表现了基因或DNA标志在染色体上的相对位置和遗传距离。
    ②基因组物理图测定
    基因组物理图是以已知的DNA片段作为序列标签位点（sequence-tagged site，STS），以碱基对作为测量单位的基因组图。任何DNA序列，只要知道其在基因组中的位置，都能被用作STS标签。在物理图测定时，先将染色体切割成若干个可辨认的限制性内切酶切片段，找出其上独特性的序列作为标签，分析各界标间的距离，确定个片段在染色体上的实际排列顺序。
    ③确定基因组转录图
    在基因组上确定与全部mRNA相对应的DNA的顺序位置即获得基因组转录图，又称cDNA图。利用构建的各种人工载体和基因片段的克隆技术分离到相应的cDNA片段，获得表达序列标签（expressed sequence tag，EST）组成的“表达序列图”，可得到人类“基因图”雏形。
    一般实验室所用的传统的测序方法为链终止法（chain termination method），该方法第一步是制备单链模板DNA，然后加上一小段DNA为引物与起始端配对形成双链，接着在引物之后按照模板的碱基顺序起始新链的合成。新链的合成由DNA聚合酶催化，需要加入4种脱氧核苷酸（dNTP、dNTP包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP）为新链延长的原料（底物），同时还特别加入了少量双脱氧核苷酸（ddNTP），由于DNA聚合酶不能区分dNTPs和ddNTPs，当后者随机加入到新生的单链上后，由于ddNTP核糖3’碳原子上连接的是氢原子而不是羟基，因此不能与下一个核苷酸聚合延伸，合成的新链被就此终止。按这种原理，合成的大量互补的DNA新链可在任意一个碱基的位置终止，从而所产生所有仅差一个碱基的单链分子，这些DNA分子经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，由4个泳道显示4种碱基的终止位置，而单链分子的大小又由电泳距离确定，彼此依次相差一个碱基，由下至上，便可读出新链上的DNA序列。
    ④随机测序与序列组装
    科学家们发明了鸟枪法以及在此基础上改进的克隆重叠法可引导鸟枪法来解决随机测序与序列组装问题。全基因组测序鸟枪法测序的基本原理是，用超声技术将某基因组DNA随机打成2.0kb左右的随机并有重复序列的片段，经琼脂糖凝胶电泳分离收集后，将各片段分别连接到质粒克隆载体中，构建基因文库。对基因组文库全部克隆片段进行大量随机测序，使随机测定的碱基数达到基因组的5倍以上，那么，基因组未测定的碱基数（即缺口）仅为基因组总碱基数的0.67%。鸟枪法的顺序组装是直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆，然后依次向两端延伸。这一方法不需要预先做遗传图和物理图就可以完成整个基因组顺序的组装。

  • 关注下方微信公众号，在线模考后查看

热门试题