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简答题简述定点突变技术的主要技术过程及其在酶分子修饰中的应用
  • 定点突变是在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。
    定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程如下：
    （1）、新的酶分子结构的设计
    根据已知的酶RNA或酶蛋白的化学结构和空间结构及其特性，特别是根据酶在催化活性、稳定性、抗原性和底物专一性等方面存在的问题，合理设计新的酶RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，确定欲置换的核苷酸或氨基酸及其位置。
    （2）、突变基因碱基序列的确定
    对于核酸类酶，根据欲获得的酶RNA的核苷酸排列次序，依照互补原则，确定其对应的突变基因上的碱基序列，确定需要置换的碱基及其位置。
    对于蛋白类酶，首先根据欲获得的酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密码，确定其对应的mRAN上的核苷酸序列，再依据碱基互补原则，确定突变基因上的碱基序列，并确定需要置换的碱基及其位置。
    （3）、突变基因的获得
    根据欲获得的突变基因的碱基序列及其需要置换的碱基位置，首先用DNA合成仪合成含有被置换了碱基的寡核苷酶，再用此寡核苷酶为引物通过聚合酶链反应（PCR）等技术获得所需的大量突变基因。
    （4）、新酶的获得
    将上述定位突变获得的突变基因进行体外重组，插入到适宜的基因载体中，然后通过转化、转导、介导、基因枪、显微注射等技术，转入到适宜的宿主细胞，再在适宜的条件下进行表达，就可获得经过修饰的新酶。
    定点突变技术在酶分子修饰中试一种行之有效的常用方法，定点突变技术为氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰提供了先进、可靠的手段。

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