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简答题试说明双脱氧法测定DNA序列的原理和方法？
  • 原理：在体外合成DNA的同时，加入使链合成终止的试剂，与4种脱氧核苷酸按一定比例混合，参与DNA的体外合成，产生长短不一、具有特定末端的DNA片段，由于二脱氧核苷酸没有3’-OH，不能进一步延伸产生3’，5’-磷酸二酯键，合成反应就在此处停止。
    方法：
    （1）选取待测DNA的一条链为模板，用5’端标记的短引物与模板的3’端互补。
    （2）将样品分为4等分，每份中添加4种脱氧核苷三磷酸和相应于其中一种的双脱氧核苷酸。
    （3）加入DNA聚合酶引发DNA合成，由于双脱氧核苷酸与脱氧核苷酸的竞争作用，合成反应在双脱氧核苷酸掺入处终止，结果合成出一套长短不同的片段。
    （4）将4组片段进行聚乙烯酰胺凝胶电泳分离，根据所得条带，读出待测DNA的碱基顺序。

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