试题详情
简答题设计试验,构建小鼠发情期卵巢组织的cDNA文库。
  • (一)从小鼠发情期卵巢组织中提取总RNA,(常用异硫氰酸胍苯酚法,可以使破碎细胞和灭活RNA酶同步进行)得到的总RNA流经oligo(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下(目的是稳定核酸双链),mRNA被特异地吸附在柱上,逐渐降低盐浓度,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA被洗下,经过两次oligo纤维素柱,就可以得到较纯的mRNA。
    (二)cDNA第一链的合成利用反转录酶的催化作用,以mRNA为模板,oligo(dT)为引物,合成与mRNA互补的cDNA链。
    (三)cDNA第二链的合成cDNA第一链合成完成后,得到了DNA-RNA杂交分子,用碱变性法,去除杂交分子中的RNA。进一步用DNA聚合酶I和反转录酶合成第二条链。
    (四)cDNA与接头连接机与载体连接
    (五)质粒的转化或噬菌体的包装及转染
    (六)cDNA文库的扩增
    (七)cDNA文库的筛选与鉴定
  • 关注下方微信公众号,在线模考后查看

热门试题