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简答题概述筛选和鉴定DNA重组体的常用方法。
  • 在转基因操作以后，载体只能进入部分宿主细胞，即使含有载体的细胞，也并非都含有目的基因，有些宿主细胞可能含有自身连接成环的载体分子或非目的基因与载体形成的重组体。因此，须在不同层次不同水平上进行筛选和鉴定，以确定哪一菌落所含的重组DNA分子确实带有目的基因，这一过程为筛选。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况的不同，可采用：
    （1）直接选择法：针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因，直接测定该基因或基因表型的方法。a.抗药标志的筛选：载体具有某种抗生素的抗性基因，在转化后只有含载体的细菌才能在含该抗生素的培养平板上生长并形成单菌落，而未转化细胞则不能生长，这样即可将转化菌与非转化菌区别开来。b.插入失活法：将目的基因插入载体某一耐药基因内使该基因失活，可区分单纯载体或重组载体（含目的基因）的转化菌落。如pBR322含ampr、Tetr双抗药基因，若将目的基因插入载体的Tetr基因中，则含目的基因的转化细胞只能在含Amp的培养液中生长，而不能在含Tet的培养液中生长。c.标志补救：若克隆的基因能在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这称为标志补救。如重组体为亮氨酸自养型（Leu+），将重组子导入亮氨酸异养型（Leu-）的宿主细胞后，在不含Leu的培养液中可生长，而不含重组体的细胞则不能生长。 -互补法筛选（见43题）也是一种标志补救选择方法。d.酶切图谱筛选：分别挑取独立的菌落，培养后快速提取重组体DNA，用重组时所采用的限制酶切割后，进行琼脂糖凝胶电泳，可以从DNA片段的大小和有无判断所选的菌落是否为阳性克隆。e.核酸杂交筛选：将转化子DNA或克隆的DNA分子片段转移至合适的膜上，利用标记探针进行杂交，直接选择并鉴定目的基因。f.原位杂交筛选：是将待选菌在平板上培养成菌落，按相应位置（原位）转移至合适的膜上，经变性使膜上的DNA成单链，再与标记的探针（与目的基因互补）杂交，找出平板上的菌落位置，即为重组的阳性菌落。
    （2）免疫学方法筛选：利用特异抗体与目的基因表达产物的特异相互作用进行筛选。这种方法不直接鉴定基因，属非直接筛选法。分为免疫化学方法及酶联免疫检测分析等。基本的工作原理是将琼脂培养板上的转化子菌落经氯仿蒸汽裂解、释放抗原，再将固定有抗血清的膜覆盖在裂解菌落上，在膜上得到抗原抗体复合物，最后用合适的方法检出阳性反应菌落。

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