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简答题钙调蛋白（CaM）是由148个氨基酸组成的单链分子，其pI值在3.9-4.1之间，分子量约为17KDa.该蛋白能够耐一定的高温，在900C加热3-4min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白分子中含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露出它的疏水基团。根据该蛋白的基本性质，请设计一个从牛脑组织中提取和分离纯化CaM的实验方案，要求写出具体的实验流程和每个步骤的原理，以及纯化过程中的检测和鉴定方法。
  • （1）牛脑CaM的分离提取
    在4℃条件下，取新鲜牛脑100g，除去脂肪及结缔组织等，用手术剪剪碎后，加入预冷的CaM的提纯缓冲液250mL，在预冷高速组织匀浆机中进行匀浆，所得匀浆液在4℃，15000g离心40min，收集上清液。沉淀物再用上述方法重新提取一次，合并两次上清液。将收集的上清液分批置于沸水浴中加入4min后，取出置于冰盐浴中迅速冷却。静置一段时间后再4℃、15000g离心30min，收集上清液备用。即可得到牛脑中的CaM。
    （2）牛脑CaM的纯化制备
    Phenyl-Sepharose层析柱先用缓冲液A冲洗平衡，调节蠕动泵、部分收集器、记录仪的转速。将上清液用CaC2l调Ca2+浓度约为2mmol/L上phenyl-Sepharose柱层析。上样完毕后用缓冲液A冲洗层析柱，至峰值达到基线。换用缓冲液B冲洗层析柱，至峰值达到基线。再用缓冲液C冲洗层析柱，在280nm检测出吸收峰开始收集此组织洗脱液，直至峰值达到基线。最后用大量去离子水冲洗层析柱，再重复上述步骤进入下一个循环。
    将上述收集的洗脱液与（NH4）23缓冲液透析24h，开始每2h换一次透析缓冲液，此后更换间隔可延长。24h后将袋中透析液于冷冻干燥机中冷冻干燥成粉末状，-20℃分装保存备用。
    （3）活性鉴定
    根据CaM对环核苷酸磷酸二酯酶活性对激活作用，故用PDE法鉴定牛脑CaM的活性。

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