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简答题DNA重组是酶在生物技术上的成功应用，请简述DNA重组的步骤？
  • 1.目的基因的获得
    方法有：基因文库（cDNA文库、基因组文库）、PCR（放达效应）、人工合成
    2.目的基因与载体连接
    方法有：——粘性末端——全同源性、定向克隆（两种酶切）
    定向克隆可防止高背景的产生，因为全同源性会造成载体自连、重组子、目的基因自连三种可能，重组子可能还会出现正反插入的情况，使筛选过程复杂。
    ——平末端
    酶切后也有可能产生平末端，也会出现高背景。
    ——人工接头——连接子（连入带粘性酶切位点的片断，再酶切）、普适子（一条链连上片断，成为粘性末端）、T-A克隆（PCR中使用的Taq聚合酶会根据模板延伸至后在链末尾加上一个A，可在克隆载体上加上T，使之连接）、同聚物加尾（末端转移酶加尾）
    由于平末端连接效率比较低，可在其两端人工修饰
    反应体系：目的基因、载体、T4连接酶、缓冲液
    3.重组DNA导入受体（宿主）细胞——转化、转染、转导、感染
    主要运用的是原核转化（导入感受态细菌，感受态：处于易于吸收外缘DNA的状态，方法：氯化钙法：DNA与其形成羟基-磷酸钙复合物，抗DNase水解）、真核转染。
    4.选与鉴定
    方法：
    ——遗传学（表形）——插入失活、蓝-白筛选、抗性基因（四环素Tet、氨苄青霉素Amp）
    ——酶切，在电泳（分子量、构想）
    ——PCR（特异性引物）
    ——核酸杂交（southernblot）
    ——免疫学方法（westernblot）
    ——DNA测序（sanger、焦磷酸测序）

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