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简答题用于测定蛋白质多肽链N端、C端的常用方法有哪些?基本原理是什么?
  • (1)N-末端测定法:常采用―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。
    ―二硝基氟苯(DNFB或FDNB)法:多肽或蛋白质的游离末端氨基与―二硝基氟苯(―DNFB)反应(Sanger反应),生成DNP―多肽或DNP―蛋白质。由于DNFB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定,因此DNP―多肽经酸水解后,只有N―末端氨基酸为黄色DNP―氨基酸衍生物,其余的都是游离氨基酸。
    ②丹磺酰氯(DNS)法:多肽或蛋白质的游离末端氨基与与丹磺酰氯(DNS―Cl)反应生成DNS―多肽或DNS―蛋白质。由于DNS与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定,因此DNS―多肽经酸水解后,只有N―末端氨基酸为强烈的荧光物质DNS―氨基酸,其余的都是游离氨基酸。
    ③苯异硫氰酸脂(PITC或Edman降解)法:多肽或蛋白质的游离末端氨基与异硫氰酸苯酯(PITC)反应(Edman反应),生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质。在酸性有机溶剂中加热时,N―末端的PTC―氨基酸发生环化,生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来,除去N―末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。
    ④氨肽酶法:氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶,能从多肽链的N端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解释放的氨基酸种类和数量,按反应时间和残基释放量作动力学曲线,就能知道该蛋白质的N端残基序列。
    (2)C―末端测定法:常采用肼解法、还原法、羧肽酶法。
    肼解法:蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解,反应中除C端氨基酸以游离形式存在外,其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
    ②还原法:肽链C端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的α―氨基醇。肽链完全水解后,代表原来C―末端氨基酸的α―氨基醇,可用层析法加以鉴别。
    ③羧肽酶法:是一类肽链外切酶,专一的从肽链的C―末端开始逐个降解,释放出游离的氨基酸。被释放的氨基酸数目与种类随反应时间的而变化。根据释放的氨基酸量(摩尔数)与反应时间的关系,便可以知道该肽链的C―末端氨基酸序列。
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