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简答题如何建立重组人红细胞生成素表达细胞？
  • ①构建红细胞生成素表达载体
    有两种方式获得编码人红细胞生成素基因。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链式反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后与克隆载体连接，克隆基因。另一种是提取人胎肝mRNA，逆转录合成cDNA文库，进行文库筛选，得到人红细胞生成素基因。
    ②构建表达红细胞生成素的细胞株
    以二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞系为宿主细胞。将此细胞培养于100mm培养皿中，待细胞长满至50%～60%时，用无血清细胞培养基淋洗细胞，加入由5ml无血清培养基、10ugprEPO，10ugpDHFR，60ug脂质体组成的转染混合液，37℃培养4小时。吸出培养基，加入含10%胎牛血清的F12培养基，37℃培养过夜。随后在含青霉素、链霉素及10%胎牛血清的DEME中培养，获得抗性克隆。用胰酶消化，以1：5稀释细胞，在培养基中加入MTX至浓度为1nmol/L，继续培养10-14天，至抗性克隆出现。筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞表达人红细胞生成素。

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