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- 简答题试述包含体复性的基本过程，复性过程错误发生的主要原因是什么？举例分析主要的复性方法的优缺点，为什么LC复性是最好的？
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包含体复性的基本过程：
①分离包含体：第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
②洗涤：包涵体沉淀需用去污剂（TritonX-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解。
③溶解：包涵体的溶解必须用很强的变性剂，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。去污剂可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。
复性过程错误发生的主要原因是：在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争。
复性方法的优点：透析、稀释和超滤复性法，这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，使变性剂浓度降低到蛋白质能恢复折叠的浓度。
复性方法的缺点：复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的分离纯化；透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大。
LC复性是最好的原因：与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：
①在进样后可很快的除去变性剂；
②色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在
脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；
③在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；
④便于回收变性剂，降低废水处理成本。 关注下方微信公众号，在线模考后查看
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