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简答题简述不连续凝胶电泳的原理
  • 不连续凝胶电泳的凝胶由样品胶、浓缩胶和分离胶三层组成，其中样品胶处于凝胶系统最上层的大孔径凝胶，在PH6.7~6.8的Tris-HCl缓冲液中聚合而成，含有欲分离的样品，有时可以不用这层样品胶，而直接将样品与10%的甘油或5%~20%的蔗糖混合后，加到浓缩胶的表面。浓缩胶在PH6.7~6.8的Tris-HCl缓冲液中聚合而成的大孔凝胶，除了不含样品外，其他与样品胶相同，样品中的各组分就在浓缩胶中浓缩，按照迁移率的不同，在浓缩胶和分离胶的界面上压缩成层。分离胶在pH8.8~8.9的Tris-HCl缓冲液聚合而成的小孔径凝胶，凝胶的孔径根据欲分离组分的大小通过丙烯酰胺的浓度进行调节，样品中各组分在分离胶中进行分离。在酶或其他蛋白质、核酸等进行不连续凝胶电泳时，采用阴离子电泳系统（采用pH8~9的电极缓冲液，组分带负电荷）。将制备好的多层凝胶置于电泳系统中，用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液作为电极缓冲液进行电泳，样品中各组分在浓缩胶中浓缩成狭窄的高浓度样品层。这是由于在各层凝胶中都含有HCl，HCl的离解度大，几乎全部成为Cl-，Cl-在电场中移动速度最快，称为快离子；在电泳槽中含有甘氨酸，在样品胶和浓缩胶中pH为6.7~6.8，甘氨酸只有0.1%~1%离解为负离子，在电场中移动速度最慢，称为慢离子；而蛋白质或核酸的移动速度介乎快离子和慢离子之间。接通电源电泳开始后，Cl-快速移动，走在最前面，在其后面形成一个离子浓度较低的低电导区，低电导产生较高的电位梯度，这种电位梯度促使蛋白质等组分和慢离子在快离子后面加速移动，致使蛋白质等组分在快、慢离子之间浓缩成一狭窄的中间层。
    当这一浓缩层的样品层进入分离胶的时候，由于分离胶的pH为9.5（配制分离胶时，pH为8.8~8.9，在电泳过程中，实测结果为9.5），使甘氨酸的解离度增加，泳动速度加快，很快超过所有的蛋白质等组分，高电位梯度消失，使蛋白质等组分在均一的电位梯度下进行电泳分离，加上分离胶的孔径较小，各组分因分子大小和形状不同受到分子筛效应，使某些静电荷相同的组分也可以得到分离。

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